In vitro and in silico assessment of new beta amino ketones with antiplasmodial activity

ABSTRACT Background: Based on the current need for new drugs against malaria, our study evaluated eight beta amino ketones in silico and in vitro for potential antimalarial activity. Methods: Using the Brazilian Malaria Molecular Targets (BraMMT) and OCTOPUS® software programs, the pattern of interactions of beta-amino ketones was described against different proteins of P. falciparum and screened to evaluate their physicochemical properties. The in vitro antiplasmodial activities of the compounds were evaluated using a SYBR Green-based assay. In parallel, in vitro cytotoxic data were obtained using the MTT assay. Results: Among the eight compounds, compound 1 was the most active and selective against P. falciparum (IC50 = 0.98 µM; SI > 60). Six targets were identified in BraMMT that interact with compounds exhibiting a stronger binding energy than the crystallographic ligand: P. falciparum triophosphate phosphoglycolate complex (1LYX), P. falciparum reductase (2OK8), PfPK7 (2PML), P. falciparum glutaredoxin (4N0Z), PfATP6, and PfHT. Conclusions: The physicochemical properties of compound 1 were compatible with the set of criteria established by the Lipinski rule and demonstrated its potential as a drug prototype for antiplasmodial activity.

Dehydrobufotenin extracted from the Amazonian toad Rhinella marina (Anura: Bufonidae) as a prototype molecule for the development of antiplasmodial drugs

he resistance against antimalarial drugs represents a global challenge in the fight and control of malaria. The Brazilian biodiversity can be an important tool for research and development of new medicinal products. In this context, toxinology is a multidisciplinary approach on the development of new drugs, including the isolation, purification, and evaluation of the pharmacological activities of natural toxins. The present study aimed to evaluate the cytotoxicity, as well as the antimalarial activity in silico and in vitro of four compounds isolated from Rhinella marina venom as potential oral drug prototypes. Methods: Four compounds were challenged against 35 target proteins from P. falciparum and screened to evaluate their physicochemical properties using docking assay in Brazilian Malaria Molecular Targets (BraMMT) software and in silico assay in OCTOPUS® software. The in vitro antimalarial activity of the compounds against the 3D7 Plasmodium falciparum clones were assessed using the SYBR Green I based assay (IC50). For the cytotoxic tests, the LD50 was determined in human pulmonary fibroblast cell line using the [3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] (MTT) assay. Results: All compounds presented a ligand-receptor interaction with ten Plasmodium falciparum-related protein targets, as well as antimalarial activity against chloroquine resistant strain (IC50 = 3.44 µM to 19.11 µM). Three of them (dehydrobufotenine, marinobufagin, and bufalin) showed adequate conditions for oral drug prototypes, with satisfactory prediction of absorption, permeability, and absence of toxicity. In the cell viability assay, only dehydrobufotenin was selective for the parasite. Conclusions: Dehydrobufotenin revealed to be a potential oral drug prototype presenting adequate antimalarial activity and absence of cytotoxicity, therefore should be subjected to further studies.(AU)

Submicroscopic malaria parasite carriage: how reproducible are polymerase chain reaction-based methods?

The polymerase chain reaction (PCR)-based methods for the diagnosis of malaria infection are expected to accurately identify submicroscopic parasite carriers. Although a significant number of PCR protocols have been described, few studies have addressed the performance of PCR amplification in cases of field samples with submicroscopic malaria infection. Here, the reproducibility of two well-established PCR protocols (nested-PCR and real-time PCR for the Plasmodium 18 small subunit rRNA gene) were evaluated in a panel of 34 blood field samples from individuals that are potential reservoirs of malaria infection, but were negative for malaria by optical microscopy. Regardless of the PCR protocol, a large variation between the PCR replicates was observed, leading to alternating positive and negative results in 38% (13 out of 34) of the samples. These findings were quite different from those obtained from the microscopy-positive patients or the unexposed individuals; the diagnosis of these individuals could be confirmed based on the high reproducibility and specificity of the PCR-based protocols. The limitation of PCR amplification was restricted to the field samples with very low levels of parasitaemia because titrations of the DNA templates were able to detect < 3 parasites/µL in the blood. In conclusion, conventional PCR protocols require careful interpretation in cases of submicroscopic malaria infection, as inconsistent and false-negative results can occur.

Caracterização do receptor DARC (Duffy Antigen/Receptor for Chemokines) e da resposta imune anti Duffy Binding Protein em indivíduos expostos ao Plasmodium vivax

O processo de invasão dos eritrócitos pelos plasmódios é complexo, sendo mediado por interações moleculares específicas do tipo ligante receptor. No caso do Plasmodium vivax, a invasão é altamente dependente do antígeno de grupo sanguíneo Duffy (DARC), presente na superfície dos eritrócitos, que interage com uma proteína do parasito, a Duffy binding protein (PvDBP). Considerando a importância do. receptor DARC como principal via de invasão do P. vivax, no presente estudo desenvolveu-se uma metodologia para genotipagem do receptor DARC. A técnica foi realizada através da PCR em tempo real, em sistema multiplex, o que otimizou o método de genotipagem em larga escala e reduziu o custo. Esta nova metodologia permitiu genotipar o receptor DARC dos indivíduos que participaram de um estudo. epidêmico de malária e de outros estudos com indivíduos de diferentes áreas endêmicas da região Amazônica brasileira. No presente trabalho, para avaliar a influência de DARC na infecção pelo P. vivax, duas abordagens metodológicas foram utilizadas: um estudo de prevalência e um de incidência do tipo prospectivo. Para o estudo que buscou associação de DARC com a prevalência de malária por P. vivax, foram estudados indivíduos, proveniente de outros estados brasileiros, que migraram para a Amazônia.

Nesta população foi observado que os indivíduos que possuíam dois alelos DARC funcionais apresentavam um maior risco de infecção ao P. vivax. Já no estudo prospectivo de base populacional, o receptor DARC foi genotipado em cerca de 800 indivíduos nativos da Amazônia, residentes em um assentamento agrícola na Amazônia. Embora nenhuma associação tenha sido encontrada entre o genótipo. DARC e infecção pelo P. vivax, os resultados sugeriram que o receptor DARC influenciou na resposta de anticorpos. Nesta área, indivíduos com apenas um alelo funcional (FY*B/FY*BES) apresentaram uma resposta maior de anticorpos anti-PvDBP. Estes achados são importantes, já que a relação entre DARC e a resposta de anticorpos anti-PvDBP tem sido pouco estudada. Além disso, foram determinados os. genótipos de DARC em indivíduos residentes em uma área de transmissão epidêmica de malária por P. vivax (surto ocorrido na região metropolitana de Belo Horizonte, MG), onde se avaliou também a resposta de anticorpos anti-PvDBP. Na área do surto, a caracterização dos genótipos de DARC dos indivíduos expostos à transmissão demonstrou que os diferentes genótipos estavam igualmente distribuídos entre aqueles que se infectaram e os não infectados. Por último, nesta área do surto epidêmico, estudou-se a cinética da resposta dos anticorpos anti-PvDBP. O resultados mostraram que anticorpos anti-PvDBP são de curta duração e específicos para a variante do parasito que causou o surto. Em conjunto, acredita-se que os resultados apresentados aqui possam contribuir para os estudos que visem o melhor entendimento da relação entre DARC, resposta imune e susceptibilidade a infecção pelo P. vivax.

Caracterização do receptor DARC (Duffy Antigen/Receptor for Chemokines) e da resposta imune anti Duffy Binding Protein em indivíduos expostos ao Plasmodium vivax / Characterization of the receptor DARC (Duffy Antigen / Receptor for Chemokines) and the immune response anti Duffy Binding Protein in individuals exposed to Plasmodium vivax

O processo de invasão dos eritrócitos pelos plasmódios é complexo, sendo mediado por interações moleculares específicas do tipo ligante receptor. No caso do Plasmodium vivax, a invasão é altamente dependente do antígeno de grupo sanguíneo Duffy (DARC), presente na superfície dos eritrócitos, que interage com uma proteína do parasito, a Duffy binding protein (PvDBP). Considerando a importância do. receptor DARC como principal via de invasão do P. vivax, no presente estudo desenvolveu-se uma metodologia para genotipagem do receptor DARC. A técnica foi realizada através da PCR em tempo real, em sistema multiplex, o que otimizou o método de genotipagem em larga escala e reduziu o custo. Esta nova metodologia permitiu genotipar o receptor DARC dos indivíduos que participaram de um estudo. epidêmico de malária e de outros estudos com indivíduos de diferentes áreas endêmicas da região Amazônica brasileira. No presente trabalho, para avaliar a influência de DARC na infecção pelo P. vivax, duas abordagens metodológicas foram utilizadas: um estudo de prevalência e um de incidência do tipo prospectivo. Para o estudo que buscou associação de DARC com a prevalência de malária por P. vivax, foram estudados indivíduos, proveniente de outros estados brasileiros, que migraram para a Amazônia.

Nesta população foi observado que os indivíduos que possuíam dois alelos DARC funcionais apresentavam um maior risco de infecção ao P. vivax. Já no estudo prospectivo de base populacional, o receptor DARC foi genotipado em cerca de 800 indivíduos nativos da Amazônia, residentes em um assentamento agrícola na Amazônia. Embora nenhuma associação tenha sido encontrada entre o genótipo. DARC e infecção pelo P. vivax, os resultados sugeriram que o receptor DARC influenciou na resposta de anticorpos. Nesta área, indivíduos com apenas um alelo funcional (FY*B/FY*BES) apresentaram uma resposta maior de anticorpos anti-PvDBP. Estes achados são importantes, já que a relação entre DARC e a resposta de anticorpos anti-PvDBP tem sido pouco estudada. Além disso, foram determinados os. genótipos de DARC em indivíduos residentes em uma área de transmissão epidêmica de malária por P. vivax (surto ocorrido na região metropolitana de Belo Horizonte, MG), onde se avaliou também a resposta de anticorpos anti-PvDBP. Na área do surto, a caracterização dos genótipos de DARC dos indivíduos expostos à transmissão demonstrou que os diferentes genótipos estavam igualmente distribuídos entre aqueles que se infectaram e os não infectados. Por último, nesta área do surto epidêmico, estudou-se a cinética da resposta dos anticorpos anti-PvDBP. O resultados mostraram que anticorpos anti-PvDBP são de curta duração e específicos para a variante do parasito que causou o surto. Em conjunto, acredita-se que os resultados apresentados aqui possam contribuir para os estudos que visem o melhor entendimento da relação entre DARC, resposta imune e susceptibilidade a infecção pelo P. vivax.

Plasmódios transfectados com a proteína de fluorescência verde (GFP) para ensaios de quimioterapia experimental / Plasmodium stably transformed with the green fluorescent protein (GFP) for assays of experimental chemotherapy

A resistência do Plasmodium falciparum aos principais antimaláricos ainda é o principalproblema no controle da malária humana. [...] Parasitos da malária transfectadoscom a Proteína de Fluorescência Verde (GFP) têm sido produzidos em sistema detransformação estável. Isso permite utilizar a fluorescência como um marcador paraidentificar os parasitos. Assim, buscou-se neste estudo determinar o uso potencial deparasitas da malária murina (P. berghei) e da malária humana (P.falciparum)transfectados com a GFP para os ensaios de quimioterapia experimental. Para osexperimentos in vivo, utilizou-se a cepa GFP-P. berghei que apresenta um geneexógeno de fluorescência verde e resistência à pirimetamina (Sultan et al. 1999).Camundongos suíço-albinos ou BALB/c foram infectados com a cepa GFP-P. bergheiou a cepa não transformada (NK65), por via intraperitoneal. Excluindo as drogas commecanismo de ação similar ao da pirimetamina, os resultados iniciais demonstraram quea susceptibilidade a diferentes classes de antimaláricos foi semelhante entre a cepa GFPP.berghei e a cepa P. berghei NK65. Demonstrou-se ainda que a virulência in vivo dacepa GFP-P. berghei foi similar a da cepa não transformada. A próxima etapa foivalidar a cepa GFP-P. berghei em um ensaio fluorimétrico para avaliar drogasantimaláricas. Para tal, os animais foram infectados com a cepa GFP-P. berghei,tratados com antimaláricos convencionais, e as parasitemias avaliadas pela citometria defluxo ou pelo método convencional de microscopia óptica. A parasitemia determinadapela citometria de fluxo se correlacionou com aquela determinada pela microscopiaóptica. Assim, os resultados permitiram concluir que a cepa GFP-P. berghei foiadequada para a triagem de drogas in vivo podendo substituir a técnica convencional demicroscopia óptica. [...] A cepa GFP-P.falciparum foi mantida emcultivo contínuo e as parasitemias das culturas foram analisadas, em paralelo, porcitometria de fluxo e microscopia óptica. Os resultados obt.